Abriss des Diplomarbeitsthemas

Im Jahre 1873 entdeckte Ernst Abbe die sogenannte Beugungsgrenze. Diese gibt an, dass ein Mikroskop zwei Objekte, die sich näher als die halbe Wellenlänge des ver­wen­deten Lichtes sind, nicht voneinander trennen kann. Diese Auflösungsgrenze wurde 1994 im Bereich der Fluores­zenz­mikroskopie von Prof. Hell mit dem RESOLFT-Konzept durchbrochen. RESOLFT steht für reversible saturable optically linear fluorescence transitions. Wie der Name besagt, beruht das Konzept auf Molekülen, die lichtinduziert zwischen zwei Zuständen wechseln können, von de­nen einer optisch aktiv ist. Durch das Hin- und Herschalten können Moleküle, die weniger als eine halbe Wellenlänge voneinander entfernt sind, sequentiell ausgelesen werden.

Dieses Konzept wurde zuerst durch die STED-Mikroskopie (stimulated emission deple­tion) verwirklicht. Mikroskope dieses Typs arbeiten mit Fluoreszenzmarkermolekülen, die mit einem ersten fokussierten Laserstrahl aus dem Grundzustand in einen fluores­zie­renden Zustand an­geregt werden. Unmittelbar danach regt ein zweiter, doughnut­förmiger Laserstrahl die Moleküle im Randbereich des Brennflecks durch stimulierte Emission wieder ab. Dadurch können nur die Moleküle im Mittelbereich des doughnuts spontan fluoreszieren und liefern somit ein nicht beugungsbegrenztes Signal. Beide Laser­strahlen werden über die Probe gescannt, um das Gesamtbild zu erhalten.

Die STED-Mikroskopie erwies sich als äußerst wertvoll für die Lebenswissenschaften, denn nun können Objekte und Strukturen in lebenden Zellen beobachtet werden, die bislang nur durch Elektronen- und Rasterkraftmikroskopie in fixierten Zellen sichtbar gemacht werden konnten. Um Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Proteinen in vivo verfolgen zu können, die mit unterschiedlichen Farbstoffen markiert wurden, und Rückschlüsse auf ihre Funktionsweise zu ziehen, sind STED-Mikroskope nötig, die mehrfarbige Bilder aufnehmen können.

Bislang sind Aufnahmen mit bis zu drei Farben möglich. Dabei werden zwei Marker durch ihre Fluoreszenzlebensdauer unterschieden und ein dritter durch die Emissions­wellenlänge. Dazu sind allerdings 4 Laserstrahlen nötig, was technisch nicht einfach umzusetzen ist.  In dieser Diplomarbeit soll ein anderes Mehrkanal-STED-Mikroskop mit entwickelt werden.